一、 人外周血单个核细胞（PBMC）的分离

1. 3ml抗凝血加入3ml 1×PBS进行稀释。

2. 在15ml离心管内加入3ml淋巴细胞分离液，再在液面上方平铺3ml稀释过的抗凝血，常温下，水平离心机600g，离心30min。

3. 吸取中间白膜层细胞，加入15ml离心管中，再加入10ml 1×PBS混匀，常温下，1000rpm，离心10min，弃上清，每管加入2ml MACS缓冲液重悬细胞并计数，调整细胞数量，每个样本不超过107个细胞。

4. 2000rpm，离心3min，弃上清。

二、 磁珠分选

1. 每管加入40ul MACS缓冲液重悬细胞，再加入10ul CD4+T Cell Biotin-Antibody Cocktail, human，混匀，4℃孵育5min。

2. 每管加入30ul MACS缓冲液，再加入20ul CD4+T Cell MicroBead Cocktail,human，混匀，4℃孵育10min。

3. 将分选柱置于磁力架上，加入3ml MACS缓冲液润洗柱子，待液体不再流出，更换新的离心管。

4. 将细胞悬液加入分选柱，待液体不再流出，加入3ml MACS缓冲液洗柱子，液体收集完毕，将离心管撤离后，再将分选柱撤下。

5. 将收集到的细胞悬液进行离心，1500rpm，5min，去上清。

三、流式鉴定